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鸡传染性支气管炎病毒D41株S1 基因序列测定及分析
  

本研究首次报道了IBV 广东地方分离株D41S1 基因的全序列, 并通过限制性内切酶鉴定分析, 证明测序结果是准确可靠的。结果表明该基因全长1611bp(从ATG 到S 前体蛋白裂解位点), 编码一条由537 个氨基酸组成的多肽, 分子量约59KD, 其中包括S 蛋白的信号肽。

鸡传染性支气管炎(IB)是严重危害世界养鸡业的一种病毒性疾病, 其病原为鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。IBV 的基因组核酸在复制过程中易发生突变和高频重组, 从而导致该病毒血清型众多, 并给IB 的防治工作带来很大麻烦。现已发现, 在IBV 的三种主要结构蛋白中, 纤突(S)蛋白的S1 糖多肽亚单位与IBV 的免疫原性关系最密切, 血凝抑制抗体和多数病毒中和抗体由S1 诱发, 血清型特异性抗体也主要是针对S1 糖多肽的。另外, IBV 基因组中的高变区大多集中在S1 部位。所以S1 基因是IBV 的免疫原基因, 研究其序列, 有利于从分子水平上揭示IBV 的变异基础和规律, 并对开发相应的基因工程疫苗有重要意义。本研究对IBV 广东地方分离致弱毒株D41(简称IBV D41 株)的S1 基因进行全序列测定, 以期为国内IBV 分子流行病学研究提供依据, 并为进一步表达IBV D41株S1 基因奠定基础。

1、材料与方法

1.1 引物设计与合成 

上游引物Ls 根据手工测序获得的IBV D41株S1 基因5′端部分序列(另文报道)设计。为避免引物内部形成二级结构或上、下游引物之间有互补链存在, 在不改变编码氨基酸序列的前提下, 将原序列中第九位的A 改为C 。下游引物Lx 按照Massachuset ts(Mass)血清型毒株     (M41      、Beaudet te 、H120    等)S 蛋白(前体)裂解位点附近的序列设计。为方便今后的表达, 在其中引入了翻译终止密码子TAG 的互补序列。Ls 和Lx 的5′端分别加有EcoRⅠ 和Sac Ⅰ 的识别序列, 两条引物均为25 个碱基, 由上海Sangon 生物工程公司合成, 跨幅约1.6Kb 。

1.2 IBV D41株S1 基因cDNA的获取及鉴定 

以本室构建的重组质粒pGEMIBV Ⅰ.D41(内含带有先导序列的IBV D41株S1 基因cDNA)为模板, 进行常规质粒PCR, 反应程序如下:93 ℃1min , 55 ℃1min , 72 ℃2min , 循环30 次, 最后于72 ℃再延伸10min 。反应前先将模板和引物于97 ℃水浴10min 。另以不含模板的反应体系同时作为阴性对照。获得的特异性扩增产物经初步纯化后, 分别用EcoR Ⅰ、SacⅠ和Bgl Ⅱ做单酶切鉴定。

1.3 目的基因的克隆、鉴定及纯化 

按BOEHRINGER MANNHEIM 公司的琼脂糖酶使用说明纯化上述S1 基因cDNA  PCR 扩增产物。然后参照Sambrook和熊占等的方法将其与pGEM-7Zf(+)载体连接。重组质粒用EcoR Ⅰ +Sac Ⅰ 和EcoR Ⅰ +Hind Ⅲ双酶切以及质粒PCR 鉴定, 最终再通过PEG 沉淀法纯化。

1.4 测序 

在加拿大Genda 公司的帮助下, 利用ABI PRISMTM 377 型全自动测序仪, 读取IBV D41株S1 基因cDNA 的全序列(不含先导序列)。

1.5 序列分析及鉴定 

利用DNASIS 和PROSIS 软件辅助分析IBV D41株S1 基因的核酸序列及推导出的氨基酸序列。同时根据酶切位点分析数据, 选EcoR Ⅰ 、Pst Ⅰ 、Hae Ⅲ 、XcmⅠ(Biolab 公司)和BstY Ⅰ(Biolab 公司)等限制性内切酶对重组质粒及质粒PCR 产物进行鉴定, 以验证测序结果。

2、结 果

2.1 引物设计与目的基因的获取、鉴定 

经过PCRDESN 软件分析, 引物Ls 和Lx 内部均没有连续4 个以上碱基构成反向互补配对序列, 二者3′末端也无同源性, 不会形成引物二聚体。利用这对引物通过PCR 方法, 顺利地从重组质粒pGEMIBVS1-Ⅰ .D41 中扩增出了大小约1.63Kb 的目的片段, 与预期完全吻合(图1)。该产物用EcoR Ⅰ 、Sac Ⅰ和Bgl Ⅱ分别酶切, 大小未发生变化(图2), 初步表明其内部无这三个酶的识别序列。

2.2 重组质粒的鉴定 

重组质粒命名为pGEMIBVS1-Ⅱ.D41 , 对其用EcoR Ⅰ +Sac Ⅰ 双酶切后, 产生一条约1.63Kb 的小片段和一条约3.0Kb 的大片段, 它们分别与目的基因以及载体质粒的大小一致。而用EcoR Ⅰ +Hind Ⅲ酶切pGEMIBVS1-Ⅱ.D41时, 仅得到一条约4.63Kb的大片段。用引物Ls 和Lx 对重组质粒进行PCR , 得到唯一一条约1.63Kb 的片段。以上结果(图1)表明IBV  D41株S1 基因cDNA(不含先导序列)已正确插入载体质粒pGEM-7Zf(+)上用EcoR Ⅰ和Sac Ⅰ切开的窗口中。

2.3 IBV D41株S1 基因全序列测定 

IBV D41株S1 基因的核酸全序列及推导出的相应氨基酸序列见图3 。其中未测出的碱基标记为N , 相应的尚不明确的氨基酸用X 表示。

2.4 测序结果鉴定 

如图4 所示, 用Pst Ⅰ酶切S1 基因cDNA(不带先导序列)可获得两个片段:0.6Kb 和1.0Kb ;用Hae Ⅲ酶切可获得三个片段:0.3Kb 、0.4Kb 和0.9Kb ;用Xcm Ⅰ 酶切也可获得三个片段;0.1Kb 、0.5Kb 和0.9Kb ;BstY Ⅰ 酶切则可获得两个片段:0.6Kb 和0.9Kb 。这与测序结果反映出的酶切图谱完全一致, 从而证明所获得的序列的确是IBV D41株S1 基因的全序列(不含先导序列)。另外, 用EcoR Ⅰ +Pst Ⅰ 消化pGEMIBVS1-Ⅱ.D41质粒DNA 后可得到大(约4Kb)、小(约0.5Kb)两个片段(图1), 由于载体中无Pst Ⅰ 位点, 所以该位点必然位于插入片段内部, 这进一步说明重组质粒pGEMIBVS1-Ⅱ.D41构建正确。测序结果鉴定 如图4 所示, 用Pst Ⅰ酶切S1 基因cDNA(不带先导序列)可获得两个片

3、讨 论

3.1 引物设计 IBV 基因组核酸(尤其是S1 基因)具有高频突变的特点, 所以引物设计要根据不同的研究目的有所侧重。例如本研究使用的一对引物就是基于两个目的设计的, 一是调取完整的S1 基因, 二是方便今后表达该基因。因此上游引物由翻译起始密码子ATG 开始,下游引物结束在S1 和S2 裂解位点处, 并引入翻译终止密码子TAG 的互补序列。但如果主要目的是调取一个新的IBV 变异株的完整S1 基因, 则上游引物最好设计在先导序列中, 并包含保守性很高的侧翼序列CTG/TAACAA。而下游引物可跨在S 前体蛋白裂解位点附近。另外, 对引物上附加的限制性内切酶识别序列的选择要慎重, 必要时在克隆前应做预酶切。

3.2 测序及分析 

本文首次报道了IBV 广东地方分离株D41S1 基因的全序列, 并通过限制性内切酶鉴定分析, 证明测序结果是可靠的, 能够直接用于RFLP 、RT-PCR 等相关研究。同时, 这项成果还弥补了国内在IBV 地方分离株S1 基因序列数据方面的不足。

测序结果表明, IBV D41株S1 基因共包括1611 个碱基(从ATG 开始到S 前体蛋白裂解位点止), 其中有5 个碱基未测出, 占全序的0.3 %, A 、G 、C 、T 四种碱基的分布为:A —27.0 %(435/1 611)、G —19.2 %(310/1 611)、C —16.6 %(267/1 611)、T —36.9 %(594/1 611)。对该基因序列进行限制性内切酶位点分析发现, 其中无EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、BamH Ⅰ 、Bgl Ⅱ 、Sac Ⅰ和Sal Ⅰ等常用酶的识别序列, 这与国外报道的对许多IBV 毒株S1 基因序列分析的结果一致。因此克隆S1 基因时, 不妨首先考虑从这些酶中选择克隆用酶。测序结果还表明,BstY Ⅰ在967 位有一个切点,Hae Ⅲ在415 位和132 位以及Xcm Ⅰ在106 位和693 位各有两个切点。参照国外的报道, IBV D41株S1 基因cDNA 的Hae Ⅲ 、BstY Ⅰ 和Xcm Ⅰ的酶切图谱与Mass 血清型的标准毒株Beaudet te 及M41 基本一致, 而与标准肾变型毒株Gray 和Holte 截然不同。因此, 从基因分型的角度看, D41 株与Beaudet te 株和M41株属于同一型。这与王林川等人的报道吻合 。另外, 我们还注意到IBV D41株S1 基因内部有一个Pst Ⅰ 识别位点(554 位), 该位点也常出现在其它IBV 毒株的S1 基因中。考虑到Pst Ⅰ 来源方便, 并在许多载体质粒中背景清楚, 因此, 将Pst Ⅰ用于S1 基因的鉴定及亚克隆, 是个很好的选择。

根据测序结果, 我们推导出了D41株S1 糖蛋白的氨基酸序列。它包括537 个氨基酸, 编码一条分子量约59KD 的多肽, 其等电点为7.75 , 接近中性。序列中潜在的N-糖基化位点有17个, 与二硫键形成有关的半胱氨酸残基的数量为18 个。疏水性分析表明, 该多肽N 端有一段较强的疏水区, 包括18 个氨基酸, 其中第16 位的半胱氨酸和第18 位的丙氨酸均为中性小氨基酸, 这些结构符合信号肽的共同特征, 因此可判定该部位为S 蛋白的信号肽。另外, 序列内部无终止密码, 这说明我们获得的IBV D41株S1 基因是完整的, 可用于今后体外表达研究。

专家介绍
廖明 

作者介绍:廖明,1968年生,中共党员,博士,华南农业大学副校长、教授,博士生导师,广东省“珠江学者”特聘教授,华南农业大学“预防兽医学”国家重点学科和“兽医学”广东省重点学科带头人。2013年6月,获“全国师德楷模”荣誉称号。 2017年05月,获得全国创新争先奖。

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