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鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达
  

将含有传染性支气管炎病毒( IBV )广东地方分离株D41的S1基因cDNA(从ATG到S前体蛋白裂解位点)的片段克隆到具有多角体启动子( PXIV )和人工合成启动子( Psyn)的杆状病毒转移载体质粒pSXIVVI+ X3 中,构建了重组转基因载体质粒pSXIVVI+ X3 -S1. D41。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒TnNPV-SVI- G DNA ( occ- , g al+)共转染草地夜蛾( Sf9)细胞,筛选并纯化出既能表达S1基因又能形成多角体的重组病毒TnNPV-IBVS1-o cc+ ( occ+ , gal- ) 。通过间接ELI SA和Wester n-blo t等方法在感染了重组病毒的Sf9细胞中成功地检测到分子量约62 000的S1基因表达产物。虽然该重组S1糖蛋白可能由于N -糖基化不完全而分子量小于天然蛋白,但它可以像正常病毒粒子一样,被鸡抗IBV D41株血清特异识别。

鸡传染性支气管炎病毒( IBV )的3种结构蛋白中,纤突( S)蛋白的S1糖多肽亚单位与IBV 的免疫原性关系最密切。血凝抑制抗体和多数病毒中和抗体,以及血清型特异性抗体都主要是针对S1的。本研究将从我国广东省采集、分离、筛选、鉴定, 并经鸡胚传代致弱的1个弱毒疫苗株IBV D41株的S1基因,导入既能表达外源基因又能形成多角体的杆状病毒载体系统 ,进而利用昆虫细胞表达该基因,为今后开发新型鸡传染性支气管炎基因工程疫苗创造了条件。

1、材料与方法

1.1 引物 

引物Ls和Lx, 是本室专门为调取IBV D41株S1基因而设计的。

1.2 重组杆状病毒转基因载体质粒的构建 

如图1所示, 先用Eco RI+ Bg l Ⅱ 酶切重组质粒pAcHLT-S1. D41 (含无先导序列的IBV D41株S1基因cDN A,由本室构建) ,回收约1. 66 kb 的目的基因。然后,参照文献[4]的方法,将该基因插入杆状病毒转移载体质粒pSXIVV I+ X3(中山大学生命科学院提供)用同样2个酶切出的窗口中,通过限制性内切酶分析及质粒PCR鉴定,最终得到重组杆状病毒转基因载体质粒p SX IVVI + X3-S1. D41。

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1.3 病毒与昆虫细胞 

野生型粉纹夜蛾核型多角体病毒( TnN PV,表现型为occ+ 、gal+ ,引自英国自然环境研究委员会病毒研究所)、含合成启动子和β -半乳糖苷酶基因的无包涵体粉纹夜蛾重组亲本病毒株( TnN PV-SV I- G, 表现型为occ- 、g al+     )、草地夜蛾( Sf9)细胞等,均由中山大学生命科学院提供。

1.4 重组杆状病毒的构建及筛选鉴定 

通过磷酸钙共沉淀法,将亲本病毒TnN PV-SV I- G的DN A及经PEG法纯化的重组转基因载体pSXIVV I+ X3-S1. D41质粒DN A共转染Sf9细胞。挑选形成多角体的病毒斑,进行数轮空斑纯化后得到不含β -半乳糖苷酶基因(g al- ) , 但形成多角体( occ+ )的重组杆状病毒TnN PV-IBV S1-occ+ 。最终抽取该重组病毒DN A,进行Eco RI酶切分析及PCR鉴定, 并用本室制备的D41株S1基因特异性长臂光敏生物素标记核酸探针作Do t-blo t杂交。

1.5 鸡抗IBV D41株多克隆抗体的制备 

取刚出壳的健康AA鸡(广东南海市狮山种鸡场)隔离饲养至2周龄,按常规方法免疫4次并制备血清后,用间接ELISA方法测定该血清效价,同时用正常鸡胚尿囊液和含IBV D41株病毒、禽流感病毒( AIV , H7N3 型)、鸡传染性喉气管炎病毒( ILTV)、鸡新城疫病毒(N DV, La Sota 株)的鸡胚尿囊液,以及传染性法氏囊病病毒( IBDV )组织毒检测该血清的特异性。

1.6 表达产物的鉴定 

感染重组病毒或亲本病毒的Sf9细胞( 20 pfu /细胞, 1× 106 细胞/m L) ,以及正常的Sf9细胞于27℃培养72 h后收集,并立即作以下检测。一抗为鸡抗IBV D41株血清,二抗为鼠抗鸡IgG McAb-HRP(广东省农业科学院兽医研究所提供)。

1.6.1 间接ELISA检测 按常规间接ELISA进行,显色剂用TMB-H2O2。

1.6.2 免疫斑点印迹检测 将样品分别抽吸到N C 膜( Bio-Rad 公司)上, 37℃封闭(含5%脱脂奶粉的PBS) 1 h。先后加入一抗和二抗于37℃各作用1 h。其间用含0. 2% Tween 20的PBS洗膜数次。最后经TBS缓冲液( 150 mmo l /L NaCl, 50mmol /L Tri s-HCl ( pH7. 5)洗膜数次, 再将膜放入新鲜配制的底物溶液(含0.5 g /L DAB及1m L /L30% H2 O2 的TBS液)中显至棕色斑点出现为止。

1.6.3 SDS-PAGE检测 细胞样品用常规方法进行SDS-PAGE,观察蛋白带型。

1.6.4 Western-blo t检测 染色步骤同免疫斑点印迹检测。

2、结果

2. 1 重组杆状病毒转基因载体质粒的构建 

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如图2所示,转移载体质粒pSX IVV I+ X3 用Xho Ⅰ酶切得到1条约5. 8 kb 的片段,用Bam HI 和Sac Ⅰ 酶切则产生1个约0. 5 kb的小片段和1个约5. 3 kb的大片段,与pSX IVVI + X3 的物理图谱完全一致,说明该转移载体质粒正确。当用Eco RI+ Bg l Ⅱ 酶切重组转基因载体质粒pSXIVVI+X3-S1. D41时,得到1. 66 kb和5. 8 kb 的2个片段。用Eco RI和Pst Ⅰ 酶切该质粒,产生了3个片段0. 6 kb、1. 0 kb和5. 9 kb,这与实验设计吻合。进一步对重组质粒进行PCR扩增后,获得唯一一条约1. 6 kb的特异条带(图3)。以上结果充分证明重组转基因载体质粒pSXIVV I+=X3-S1. D41按设计构建成功。

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2. 2 重组杆状病毒的鉴定 

用经过数轮空斑纯化的重组杆状病毒TnN PV -IBV S1-occ+ 感染正常Sf9细胞后,镜检可见细胞核内出现大量多角体,再用含X-gal的半固体培养基作空斑测定,未见蓝色亲本病毒斑出现。比较重组病毒基因组DN A与野生型病毒TnN PV 基因组DN A的EcoRI酶切图谱,可以发现前者缺乏I片段(约7.3kb ) ,而多出3.5 kb 和5.7 kb的2个小片段(图4) ,其中5.7 kb的片段与K 片段(约5.4 kb )长度相近,在电泳照片中相互叠合,不易区分。这是由于外源目的基因( 1.66 kb)以反方向插入了亲本病毒多角体基因5′端,并带入1个新的Eco RI位点所造成的。对重组病毒DN A进行PCR检测,得到1条约1. 6 kb 的特异片段,其大小与预计的完全一致,而亲本毒株TnN PV -SV I- G用同样1对引物未扩增出任何条带(图3)。另外, Do tblt杂交试验显示能够与特异性光敏生物素标记探针反应并出现蓝紫色斑点的样品包括重组质粒pAcHLT-S1. D41 和pSX IVV I+ X3-S1. D41 的DN A、IBV D41株S1基因RT-PCR 产物、质粒pSXIVV I+ X3-S1. D41 的PCR 产物、重组病毒TnN PV-IBV S1-o cc+ 基因组DN A及其PCR产物。而质粒pXIVV I+ X3 的DN A、亲本毒株TnN PV-SV I- G DN A 及野生型毒株TnN PVDN A均不能与探针反应(图5)。以上结果表明,重组杆状病毒TnN PV-IBV S1-occ+ 构建正确,并已得到纯化。

2. 3 抗体制备 

按常规间接ELISA做棋盘滴定,经超离纯化的IBV D41株病毒抗原的工作浓度为9. 8 mg /L,鸡抗IBV D41株血清抗体的效价为1∶ 6 400,工作浓度选定为1∶ 100。特异性检测结果显示,该血清只与超离纯化的IBV D41株病毒及含IBV D41株病毒的鸡胚尿囊液起反应,而与正常鸡胚尿囊液和含AIV、ILTV、N DV 的鸡胚尿囊液,以及IBDV组织毒不发生反应。这表明上述制备的鸡抗IBV D41株血清特异性好, 可用于表达产物鉴定。

2. 4 表达产物的鉴定

2.4.1 间接ELISA及免疫斑点印迹检测 在间接ELISA试验中,阳性(超离纯化的IBV D41株)孔呈深黄色, OD值为1. 18; 感染重组病毒的Sf9细胞孔呈黄色, OD值为0. 48; 而感染亲本病毒的Sf9细胞孔及正常Sf9细胞孔不显色。在免疫斑点印迹检测中,感染重组病毒的Sf9细胞样品显出棕红色斑点,而感染亲本病毒的Sf9细胞及正常Sf9细胞均无反应(图6)。以上结果表明, IBV D41株S1基因在Sf9细胞中得到正确表达,产物能够被鸡抗IBV D41株血清特异识别。

2.4.2 SDS-PAGE 及Western-blot 检测 从SDS-PAGE结果(图7)可看出,感染重组病毒的Sf9细胞样品在60 000和62 000各有1条特异带,另在30 000附近有1条特征性的多角体蛋白带。而Western-blo t结果则显示,只有感染重组病毒的Sf9细胞样品中出现1条约62 000的棕红色特异反应带。这表明重组杆状病毒TnN PVIBVS1-occ+ 的构建完全正确,且IBV D41株S1基因在Sf9细胞中得到了表达。

3、讨论

本研究首次成功地利用杆状病毒载体- 昆虫细胞受体系统正确表达了IBV 广东地方分离株D41株的S1基因。重组S1蛋白能够被鸡抗IBVD41株血清特异识别,说明它具有类似天然蛋白的生物活性,这对今后研制鸡传染性支气管炎基因工程疫苗意义重大。

重组S1蛋白的分子量约62 000,但根据Cavanagh的报道, 成熟的S1 糖蛋白分子量约90 000,经过去寡糖处理后,分子量约64 000。由此可见,本研究获得的重组S1糖蛋白很可能是因为N -糖基化不完全而表现出分子量比天然蛋白小。类似这种糖基化不完全的现象在多个研究中已有报道。其原因可能包括: ( 1)昆虫细胞识别和修饰N -糖基化位点的能力与脊椎动物细胞有区别。例如, Tomley 等用痘苗病毒作载体,在非洲绿猴肾细胞中表达IBV Beaudet te株S基因时,可以获得与天然蛋白大小相似的完全糖基化产物。( 2)昆虫细胞对各种外源基因的表达能力不同。例如同为冠状病毒科的成员, IBV、鼠肝炎病毒( M HV)和牛冠状病毒( BCV )的S1基因虽然都能够在昆虫细胞中完整表达,但3种表达产物的糖基化程度却有差异, MHV 和BCV的要明显完全一些。这是否因为基因序列中的N -糖基化位点数目、位置及半胱氨酸保守性不同引起,尚待进一步研究。(3)表达时间的影响。有学者认为,在杆状病毒感染的最晚期,由于多核糖体在粗面内质网表面达到饱和,而耗尽了N -糖基转移酶; 或是由于蛋白自身的难溶特性造成大量带有不成熟寡糖的蛋白异常堆积于内质网中;抑或其他种种原因,导致蛋白转运速度及修饰水平下降, 最终出现N -糖基化不完全产物。(4)载体因素。本研究使用的杆状病毒载体系统在合成非融合外源蛋白的同时,也于最晚期大量表达多角体蛋白。这是否会影响某些外源基因表达产物的N -糖基化,值得探讨。

专家介绍
廖明 

作者介绍:廖明,1968年生,中共党员,博士,华南农业大学副校长、教授,博士生导师,广东省“珠江学者”特聘教授,华南农业大学“预防兽医学”国家重点学科和“兽医学”广东省重点学科带头人。2013年6月,获“全国师德楷模”荣誉称号。 2017年05月,获得全国创新争先奖。

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