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我国新城疫病毒的分子流行病学及新疫苗研制
  

当前我国及周边地区流行的新城疫病毒主要为基因Ⅶ型,而目前所使用的疫苗主要为基因Ⅱ型 La Sota 株,其与流行株的遗传距离较远。 疫苗株与流行株之间的基因型差异被认为是免疫禽群中新城疫强毒发生感染的主要原因之一,为提高疫苗的免疫效力,成功研制出了基因Ⅶd 亚型新城疫病毒致弱株, 该致弱株在控制当前新城疫的发生和流行方面具有较大的优势和潜力。

新城疫(Newcastle disease,ND)自 1926 年被确认以来, 在世界范围内广为传播已有 80 多年,它给养禽业带来了巨大的经济损失,迄今仍是禽类最重要的疾病之一 。 新 城 疫 病 毒 (Newcastledisease virus,NDV)自 1946 年在我国首次分离至今已在中国存在了 60 多年。 NDV 一直处于不断的进化之中,目前已产生了多个不同的基因型,由近十多年来的 ND 流行特点可知,从不同种类宿主临床病例中所分离到的 NDV 毒株绝大多数属于基因Ⅶ型,而常用 ND 疫苗株 La Sota 的基因型为Ⅱ型,虽然它们同属一个血清型,但在遗传距离上流行株与常用疫苗株相差较远。 因此,国内外多位学者研究认为: 常规疫苗对当前 NDV 强毒株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力,有必要研制新型的替代疫苗或者进一步改善疫苗当前的生产工艺,以应对 ND 流行的新情况。

1、新城疫病毒的基因组及基因型

NDV 的基因组为不分节段、 单股负链 RNA。病毒基因组结构模式为 3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,依次编码 6 种结构蛋白:核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein,NP)、磷蛋(Phosphoprotein,P)、基质蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、 血凝素-神经氨酸酶蛋白 (HeamagglutininNeuraminidase protein,HN)和大分子 蛋 白(Largeprotein,L), 其中 F 和 HN 蛋白是 NDV 表面重要的 2 个囊膜糖蛋白, 它们在病毒免疫中扮演了重要的角色。

NDV 基因组全长有 15 186、15 192 和 15 198 个核苷酸 3 种形式。其中前 2 种基因长度的 NDV属于 ClassⅡ;最后 1 种基因组长度的新城疫病毒属于 ClassⅠ,主要分布于野生和家养水禽中,而当前所用疫苗株和引起历史上 ND 4 次大流行的毒株均属于 ClassⅡ。 根据病毒 F 基因的序列,目前 ClassⅡ中的 NDV 可被分为Ⅰ~Ⅸ 9 个基因型,其中基因Ⅰ~Ⅳ型病毒的基因组长度为 15 186 个核苷酸,主要分离于 20 世纪 60 年代之前;而 60 年代后的分离株,主要为基因Ⅴ~Ⅷ型,其基因长度为 15 192 个核苷酸。

2、当前我国及周边地区新城疫病毒分子流行病学

近年,由于疫苗的广泛使用,ND 的发病率和死亡率均得到了较好的控制, 但自 20 世纪 90 年代以来, 临床上非典型 ND 的发生现象十 分 普遍。 自上世纪 90 年代中期以来,在鹅群中也常见ND 的暴发与流行,此外,近年来也偶见一些鸭群发生 ND,说明 ND 的易感宿主范围在进一步扩大。 因此,新城疫仍然是危害世界养禽业的主要疫病之一。

流行病学数据充分证明, 当前Ⅶd 亚型在我国流行强毒株中已占有绝对优势。 扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室于 2005~2006 年间所分离的 20 个 NDV 强毒株中有 18 个属基因Ⅶd亚型,其它 2 株为基因Ⅲ型,而 2007~2008 年所分离的 40 多个 NDV 强毒株全部属于基因Ⅶd 亚型。另外,中国动物流行病学研究中心提供的数据显示:2005~2006 年间该中心所收集的 145 个 强毒分离株中有 141 个属于基因Ⅶd 亚型,还有 3 个为Ⅲ型毒株。山东省家禽研究所秦卓明研究员对 1996~2005 年之间分离的24 个强毒株的基因型鉴定结果显示: 除了 3 个基因Ⅸ型和 1 个鸽源Ⅵb亚型毒株外,其余 20 个强毒株均为基因Ⅶ型,而其中Ⅶd 亚型就占到了 19 株。 2007 年 Lien 等于2003~2006 年在中国台湾所分离的 20 个 NDV强 毒 株 全 部 为 基 因Ⅶd 亚 型 ,同 样 ,Ke 等对2002~2008 年分离自台湾的 NDV强毒的鉴定结果表明,所分离的 30 个毒株也均属于基因Ⅶ型。

此外,病毒的鉴定结果显示,在亚洲其它地区流 行 的 NDV 毒株绝大多数也属于基因Ⅶ型 。Mase 等对 2001~2007 年分离自日本的 17 个毒株的基因进行了鉴定,结果显示,其中鸡源分离株均为基因Ⅶ型;cho 等发现,2000~2006 年分离自韩国的 NDV 毒株中, 有 56 个归为基因Ⅶ型;Tan于 2004~2005 年在马来西亚共分离到了8 个毒株,这些毒株也均为基因Ⅶd 亚型。据报道,当前非洲流行的毒株的主要基因型也为Ⅶd 亚型。 因此有学者认为当前世界上正处于 NDV 的第四次大流行中, 而引起此次流行毒株的基因型主要为Ⅶd 亚型。

3、疫苗株与流行株抗原差异性分析

虽然 NDV 血清型只有 1 个, 但是其基因型却有多个, 表明 NDV 的基因组在选择压下正处在持续进化之中, 交叉中和试验结果表明不同基因型毒株间的抗原性存在一定的差异。 在交叉中和试验中为了解病毒之间的抗原性差异, 根据公式 R= r1r2,计算抗原相关性值 R,其中,r1=B 病毒血清对 A 病毒的中和抑制滴度/A 病毒血清对A 病毒的中和抑制滴度;r2=A 病毒血清对 B 病毒

中和抑制滴度/B 病毒血清对 B 病毒的中和抑制滴度,R 值小于 0.5 时表明两病毒之间存在抗原性差异。 台湾学者 Lin 等对基因Ⅱ型疫苗株与流行株之间进行了交叉中和试验,数据显示:流行毒株与 B1 和克隆 30 株之间的抗原性差异值(R)主要在 0.15~0.5 之间, 从而证明流行株与疫苗株之间存在明显的抗原差异。 李志杰等在研究F48E9 和鹅源分离株 NA-1 之间的抗原差异时,发现两毒株之间的抗原性差异值 R 小于 0.5,同样表明不同基因型两毒株的抗原性存在差异。 目前普遍认为: 新城疫疫苗株与当前流行株之间的基因型和抗原性差异是引起免疫鸡群中感染强毒的主要原因。

HN 蛋白是 NDV 囊膜上最大的纤突糖蛋白,具有识别靶细胞上的唾液酸受体,介导病毒对靶细胞的吸附,并促使新生的病毒子从感染细胞膜表面释放的功能,在免疫反应中扮演着重要的角色。HN蛋白有跨膜区、茎部和球状区 3 个部分组成,其中球状区分布了所有单克隆抗体所识别的抗原位点、受体结合位点和神经氨酸酶活性位点。 作为重要的保护性抗原蛋白,HN 蛋白始终被研究者们所重视。 Iorio 等已证明在 HN 蛋白上存在 5 个最强的抗原区, 分别为 193~201 位、345~353 位、513~521 位、494 位及 569 位氨基酸区域,这与抗原表位分析软件预测结果基本符合。 研究结果显示:这些区域或其邻近氨基酸序列的变化都会导致毒株与单抗的反应性发生根本性的改变。 随机选取近年来扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室分离的部分毒株(均为Ⅶd 亚型),就这些区域氨基酸的序列与常规基因Ⅰ和Ⅱ型疫苗株进行比对后发现:流行株 HN 蛋白在这些区域或邻近的氨基酸与疫苗株存在明显的不同 (见图 1): 疫苗株在203、342、494~495、508~509、514 及 570 位的氨基分别为酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)和缬氨酸(V)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)及甘氨酸,而基因Ⅶ型分离株相应的位置则分别为组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸和谷氨酸(E)、天冬酰胺和异亮氨酸、缬氨酸及精氨酸(R)。 其中除2 个氨基酸为保守性替换外,其它氨基酸的改变都分别涉及到极性、结构及所带电荷的变化,这些不同位点在疫苗株与流行株之间同时存在,表明它们之间在一定程度上会存在抗原性的差异。

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4、基因Ⅶ型 NDV 致弱株的研制

基于上述原因, 新城疫病毒新型疫苗的研制已成为当前禽类疫苗的研究热点, 近年来 NDV反向遗传技术的发展给新型疫苗的研制带来了又一次新的革命。 2008 年 Cho 等以 La Sota 基因组作为骨架, 将Ⅶ型流行毒株 KBNP-4152 的 F和 HN 基因替换 La Sota 基因组上的相应部分,并对基因组进行了一系列的致弱突变, 进而成功获得 重 组 了 基 因Ⅶ型 F 和 HN 基因的致弱毒株KBNP-C4152R2L。 以该重组病毒和 La Sota 制成灭活疫苗后分别免疫 115 日龄蛋鸡, 免疫 3 周后再以另一基因Ⅶ型流行毒株 SNU5074 攻毒,试验结果显示:攻毒后第 2 周和第 4 周,重组病毒疫苗免疫组试验鸡的产蛋率分别为 93.2%和 94.3%,而La Sota 免疫组鸡的产蛋率仅为 81.7%和 87.3%,与含Ⅶ型 F 和 HN 基因的重组病毒免疫组相比下降了近 10%(见图 2)。

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扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室研究人员利用反向遗传技术, 成功拯救出了基因Ⅶ型毒株 ZJ1,在实施致弱突变和基因修饰后,获得了首个基因Ⅶ型 NDV 致 弱 株 NDV / ZJ1HN,其MDT 大于 120 h 且 1 日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)仅为 0.16,表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。 另外,细胞感染试验结果显示,突变毒株在成纤维细胞上不能产生细胞病变,进一步证明: 突变株 NDV/ZJ1HN 毒力已完全减弱。 此外, 该致弱株在鸡胚上具有较佳的繁殖性能,其尿囊液的血凝价和鸡胚半数感染量(EID50)可分别达到 10 log2 和 109.0/0.1 mL。致弱病毒的毒力返祖一直是诸多科研工作者所担心的问题,为了防止致弱后病毒毒力的返强, 扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室对拯救毒株 F 裂解位点的多个氨基酸同时实施了突变, 大大降低了回复突变的概率。 致弱株 NDV/ZJ1HN 在鸡胚上连续传代 15 次后, 每代病毒的 MDT 均在 120 h 左右,其毒力相当稳定。 该致弱株与 La Sota 分别以活苗和灭活苗免疫试验鸡 4 周后,再以基因Ⅶd 亚型NDV 强毒株 JS2/06 (MDT=45.6 h,ICPI=1.90)攻毒,试 验 数 据 显 示:与 常 规 疫 苗 株La Sota 相 比,致弱株不仅能有效降低攻毒后试验动物的排毒率,而且能显著减少喉气管和泄殖腔中的病毒含量,La Sota 免疫组在排毒高峰时的病毒量为基因Ⅶ型弱毒株免疫组的 10 倍以上(见图 3、4)。

致弱毒株 NDV/ZJ1HN 的亲本毒株为基因Ⅶd 亚型,与我国流行毒株的基因型完全一致。 动物试验结果显示,致弱毒株免疫动物后,其免疫效果明显优于基因Ⅱ型 疫 苗 株 La Sota 免 疫 组,因此, 该Ⅶ型致弱株在控制当前新城疫的发生和流行方面具有较大的优势和潜力。

5、结 语

自上世纪 90 年代末以来,引起我国 ND 流行的优势毒株为基因Ⅶd 亚型, 而最常用的 ND 疫苗为基因Ⅱ型弱毒株 La Sota,优势流行毒株与疫苗株相比,遗传距离越来越远,因此即使常用疫苗可诱导产生高滴度 HI 抗体, 但在流行株强毒攻击后, 免疫鸡的喉气管和泄殖腔中仍可含有较高滴度的病毒载量, 从而为免疫鸡群中流行毒株的传播提供了机会。国内外实验室研究业已证明:使用与流行株同型的基因Ⅶ型疫苗可以有效降低免疫鸡群中 NDV 强毒的携带量及感染率,这种新型疫苗对控制我国 ND 流行有着非常广阔的应用前景。

专家介绍
刘秀梵 

作者介绍:动物传染病学专家。出生于江苏省靖江市。1965年毕业于苏北农学院,中国工程院院士,中国畜牧兽医学会理事,动物传染病学分会副理事长。现任扬州大学兽医学院教授、博士生导师,国家重点学科预防兽医学学科带头人,农业部畜禽传染病重点开放实验室主任。

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