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9株猪瘟分离毒株的致病特性
  

 采用 9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第 3代细胞毒作为种毒 ,按 3 m L /头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪 ,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪 1头或 2头 ,或上一代传代猪发病后 ,同圈放入 1头或 2头试验猪进行同居感染。 如此进行 , GDGZ1 /95、 B JCY1 /96和 JL1 /94传至 8代;FJFQ1 /99传至 7代 ; HeBHH1 /95、 HeNBY1 /96、 B JTX3 /96、 GXB H1 /98和 HeNXH2 /98传至 3代。结果显示: 上述分离株传至 3~ 5代过程中均表现出毒力增强的趋势 ,从 3~ 5代传代到 8( 7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定 ,且均超过了标准石门强毒株的发病特点。 所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状 ,解剖后均表现出不同程度的病理变化 ,死后或解剖后的各种脏器经 HCFA检查均为强阳性 ,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物 ,各毒株之间毒力没有明显差异。 对其中 7株分离株传代血毒部分代次 E2基因主要区域进行序列分析 ,结果仅GDGZ1 /95株从 F1~ F8代中的 F6代有 2个核苷酸的差异 ,引起 1个相应氨基酸的变异 ,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异 ,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性。

猪瘟是由黄 病毒科 ( flaviviridae )瘟病毒属(Pestivirus) 的 猪 瘟 病 毒 ( classical swine fev ervirus, CSFV )引起的猪的高度接触性传染病 ,在《国际动物卫生法典》 ( 2003年版 )中被列为 A类 16种法定传染病之一。 猪是自然条件下对猪瘟病毒唯一易感的动物 ,毒力是猪瘟病毒重要的病原学特征之一 ,病毒因素与宿主之间的相互作用决定猪瘟感染的过程和结果。普遍认为 ,猪瘟病毒不同流行毒株之间毒力差异较大 ,存在着强、中、低毒力之分。 临床上 ,急性 猪瘟通常由强毒株引起 ,在 1~ 2周内致死感染猪;非典型和温和性猪瘟通常认为是由中等毒力或低毒力所致。 本试验旨在通过对具有代表性的 9个分离株在本动物体内的传代试验 ,并通过部分代次的 E2基因的序列分析来阐明自然界分离毒株的遗传稳定性 ,弄清我国目前猪瘟流行株在致病性及毒力等方面的差异 ,以及这些毒株之间的关系 ,为毒力基因的进一步研究奠定实验基础。

1、材料与方法

1.1 标准毒株和细胞 

猪瘟兔化弱毒疫苗毒( F479, 1996. 3. 28) ,由国家兽医微生物中心提供;PK-15细胞由本室保存。 细胞经猪瘟荧光抗体染色法 ( HCFA)检测无 CSFV 污染 ,方法按说明书进行;毒株和细胞经 PRV、 PRRSV、 PPV和 PCV 检测为阴性 ,由农业部兽医诊断中心进行 ,检测报告编号为NO. 2003363和 NO. 2004234。

1.2 试验用毒株 

从猪瘟流行毒株库中筛选 9个猪瘟流行株 ( GDGZ1 /95广东广州、 HeBHH1 /95河北黄骅、 HeNBY1 /96河南泌阳、 BJCY1 /96北京朝阳、 BJTX3 /96 北京通县、 JL1 /94吉林省吉林市、GXBH1 /98 广西 北海、 HeNX H2 /98 河南 西华和FJFQ1 /99福建福清 ) ,经 HCFA、细胞传代和电镜观察等鉴定均为阳性 ,其中 GDGZ1 /95、 HeBHH1 /95、HeN BY1 /96、 BJCY1 /96和 BJTX3 /96流行株经本动物测定 M LD。

1.3 动物 

新西兰大耳白兔 ,由本所提供;试验猪 ,购自北京房山和中国农业大学小型猪育种基地 ,约180日龄 ,经 HCFA和兔体中和试验检测为猪瘟抗原及抗体阴性。

1.4 试剂 

Trizol试剂盒、反转录试剂盒和 Taq酶等 ,购自 GIBCO-BRL和鼎国生物技术公司。猪瘟荧光抗体由本室自制 ,方法按说明书进行。

1.5 细胞传代及 TCID50测定

9个猪瘟流行株( GDGZ1 /95、 HeB HH1 /95、 HeNBY1 /96、 B JCY1 /96、 BJTX3 /96、 JL1 /94、 GXBH1 /98、 HeNX H2 /98和 FJFQ1 /99)病料经匀浆后 ,低速离心去组织碎片 ,将上清在 PK-15细胞上传 6代 ,分别测定了各代次的 TCID 50。

1.6  9株猪瘟分离株的本动物传代 

采用上述 9株分离株 的第 3 代细胞 毒作为种毒 , 按 3 mL 量( GDGZ1 /95为 3× 10 6.5  TCID 50 , HeBHH1 /95为 3×10 5.5 TCID 50 , HeN BY1 /96为 3× 10 4.5  TCID 50 , B JCY1/96为 3× 10 6.5  TCID 50 , BJTX3 /96 为 3× 10 4.5 TCID 50 , JL1 /94为 3× 10 6.0 TCID 50 , GXBH1 /98为 3× 10 5.5  TCID 50 , HeNX H2 /98 为 3×  10  4.0  TCID 50 ,FJFQ1 /99为 3× 10 7.5 TCID50 )分别接种 1或 2头试验猪。 再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪 1头或 2头;或上一代传代猪发病后 ,同圈放入 1头或 2头试验猪进行同居感染 ,作为下一代次传代用猪。如此进行 , GDGZ1 /95、 B JCY1/96和 JL1 /94传至 8代; FJFQ1 /99传至 7代;HeBHH1 /95、 HeNBY1 /96、 B JTX3 /96、 GXB H1 /98和 HeNX H2 /98传至 3代。同时进行潜伏期、濒死期及体温测定等临床症状观察 ,死亡后或濒死扑杀后记录病理变化 ,每周采集的扁桃体样本及解剖后的各种脏器经 HC FA检测病原。

1.7 部分分离株的致病力差异与遗传稳定性分析

对上述经传代的各代次血毒样本 ,进行 E2基因主要区域的 RT-PCR扩增及序列分析 。

2、结果

2.1 9株分离株在猪体传代中的临床症状及病理变化 见表 1。

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潜伏期: GDGZ1 /95、 BJCY1 /96、 BJTX 3 /96等 3株分离株在猪体上的发病潜伏期 ,由第 1代到第 8(或 3)代传代过程中 ,由 12(或 19) d 减少至 1(或 4)d,发病潜伏期呈缩短的趋势;其余 6株的潜伏期定在 4~ 6 d。 GDGZ1 /95、 BJCY1 /96、 JL1 /94 和FJFQ1 /99从第 4代到第 8(或 7)代 ,大部分传代猪发病潜伏期大大缩短 ,相当一部分猪在接毒后仅24 h即发病 ,病程均在11d以内。

体温: 9个分离株中,FJFQ1/99株在前3代都稳定在高于正常体温 0.5℃ ,只在第 1代出现一过性的增高1℃。 传 4代以后 ,体温逐代递增2℃左右 ,临死之前体温降到正常以下。此外 ,其余 8株在传代过程中 ,发病后各代次体温均升高 1~ 3℃ ,呈稽留热 ,死亡之前下降到正常体温以下。

临床症状: 9个分离株传第 1代时 ,表现为病程长或不致死 ,体温反应通常为一过性 ,然后迅速恢复为正常体温 ,表现出较急性和轻微的亚急性临床症状;从第 2代到第 3(或 4)代 ,大部分毒株均表现为典型的急性猪瘟临床症状 ,发病潜伏期逐渐缩短 ,病程也逐渐缩短 ,一旦发病 ,体温迅速升高 ,死亡快。食欲减少或废绝 ,便秘腹泻交替发生 ,便中带粘液和血液。 精神不振 ,嗜睡 ,肌肉震颤。 有的猪伴随神经症状 ,步态蹒跚 ,运动失调和痉挛抽搐等 ,衰竭而死;从第 4代到第 8(或 7)代 ,大部分猪病程均在 11 d以内 ,体温升高到 41~ 42℃ ,倦怠 ,结膜炎 ,厌食 ,畏寒 ,运动失调等特征症状 , 10 d以内快速死亡。 在传代的前期、中期和后期均出现不同程度的临床症状。

病理变化: 病毒接种后急性死亡的猪 ,表现为典型的出血性病理变化 ,其共同特点是消化道、呼吸道、泌尿生殖道和其他一些组织器官出现卡他性、纤维素性和出血性炎症反应。胸腹部和四肢内侧皮肤、黏膜、浆膜、淋巴结、心、肝、肾、膀胱等组织器官可见散在和密集分布的出血点或出血斑。 淋巴结表现为典型的“大理石”病变 ,脾脏边缘梗死 ,喉头、会厌软骨外膜有不同程度出血点。

在 9个毒株的第 1代、 GX BH1 /98株和 FJFQ1 /99前 3代的传代猪表现出较轻微的出血和脾脏梗死等病理变化。

2.2 9株分离株在传代中的致病力差异及毒力变化 见表 1。

 9个分离株在前 4(或 5)代传代中 ,发病猪的病程逐渐缩短并出现较稳定的状况 ,均维持在10 d以上 ,甚至不致死 ( FJFQ1 /99)。 发病猪的发病症状分别表现有急性、亚急性和慢性猪瘟的发病症状 ,传代毒对猪的致病力及毒力表现出增强的趋势;但在第 4(或 5)代到 8(或 7)代的传代中 ,发病猪均表现出典型的急性猪瘟的发病特征 ,病毒毒力转强并趋于稳定 ,直到第 8(或 7)代 ,病程均减少并稳定在 11d以内 ,传代毒的毒力超过了标准强毒石门株的毒力。 在前 3(或 4)代表现出强、中、弱毒力的 B JCY1 /96、 GDGZ1 /95、 JL1 /94和 FJFQ1 /99经传代至 8(或7)代时 ,其毒力均无明显变化。

9 个分离株中大部分毒株接种试验猪后 1周便可从扁桃体检到病毒 ( HCFA方法 ) , 2~ 3周后可达到感染高峰 (+ + + + ) ,并且一直持续到死亡或发生潜伏感染。 GXBH1 /98株 ( F3)直到第 79天死亡时其病毒感染仍可达到最高峰。

2.3 7株分离株在传代中的 E2基因主要区域序列测定结果

 通过对 7 株不同分离株 GDGZ1 /95、HeBHH1 /95、 HeNBY1 /96、 B JCY1 /96、 B JTX3 /96、HeNX H2 /98和 JL1 /94的传代血毒部分代次 E2基因主要区域 ( 2 485~ 2 685位 )进行序列分析 ,结果显示 , GDGZ1 /95株从 F1~ F8代 ,其中 F6代有 2个核苷酸的差异 ,引起 1个相应氨基酸的差异; HeBHH1/95 ( F1、 F2 和 F3)、 HeNBY1 /96 ( F1、 F2 和F3)、 B JCY1 /96( F1、 F2、 F5、 F6、 F7和 F8)、 B JTX3 /96( F1、 F2和 F3)、 HeNXH2 /98( F1和 F3)和 JL1 /94(F3、 F4、 F5、 F6和 F8)分离株的部分代次核苷酸及氨基酸均呈现高度保守 ,核苷酸及氨基酸同源性均为 100% 。

3、讨论

3.1 本动物传代可使猪瘟流行株毒力恢复 

普遍认为 ,猪瘟病毒不同毒株除了在抗原性方面具有差异外 ,毒力也是重要的病原学特征之一 ,不同毒株的毒力有较大的差异。特别是在田间 ,不同毒株之间的毒力和致病性差异更是明显 ,病毒的毒力除了有强中低之分外 ,其稳定性还可发生变化 ,低毒力毒株经本动物传代后 ,毒力便增强。本试验采用在田间表现强中低的 9个分离株均能使试验猪发病 ,在初次传 代时 , 这些 流行株 中 HeN BY1 /96、 HeNX H2、B JTX3 /96和 BJCY1 /96的毒力最强 ,潜伏期 1~ 14d, 30 d内试验猪全部死亡; GDGZ1 /95、 HeBHH1 /95、 JL1 /94及 GXBH1 /98毒力居中 ,潜伏期 1~ 20d,致死试验猪需 79 d,有的猪甚至不死亡; FJFQ1 /99毒力最低 ,在 4~ 6 d时体温仅升高 0. 5℃ , 4头猪全部存活 ,且没有临床症状。首次在实验室证明了我国田间猪瘟流行株具有强、中、低 3种毒力。

上述毒株传 3~ 8代后 ,初代毒力不同的毒株在传代后期毒力呈增强并保持稳定 ,并且各毒株表现出相同的致病特征。 所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状 ,解剖后均表现出不同程度的病理变化 ,死后或解剖后的各种脏器经 HCFA检查均为强阳性。传代至 8( 7)代后的 4株 ,病毒的毒力和病原性等均无明显差异 。另外 ,所有试验猪在传代过程中随着毒力的增强 ,潜伏期和病程越来越短 ,体温也越来越高 ,临床症状越来越明显 ,病理变化越来越典型。所有这些临床特点在传代至 6~ 8( 7)代后 ,仍十分稳定 ,在初代表现出的不同特点最后几乎完全趋于一致。

尽管临床上流行株之间在抗原特性、病原学特性上存在着复杂性和多样性 ,在致病性方面也存在着高中低等不同毒力的流行株 ,但通过本动物不断传代均可使毒力恢复或复壮 ,甚至超过了标准石门强毒株的毒力 ,并且都稳定在较强的程度。这种现象表明 ,田间猪瘟流行毒株之间的毒力特征没有太大

3.2 猪瘟分离株的遗传特征比较稳定 

本试验通过对 7株分离株部分代次 E2基因主要区域进行序列测定 ,从而分析其遗传稳定性 ,结果仅 GDGZ1 /95株从 F1~ F8代 ,其中 F6代有 2个核苷酸的差异 ,引起 1个相应氨基酸的差异 ,其余毒株的不同代次表现高度保守。 Va nderhallen等通过 E2基因序列分析证实 ,猪瘟野毒 Wingene93株在本动物体内传 13代并在猪肾细胞传数代后未发生变异。应成松等将猪瘟野毒株在 PK-15细胞上传代也得到相似结果 ,表明猪瘟病毒基因型遗传特性比较稳定。 然而 ,要进一步分析研究猪瘟病毒毒力从弱到强的变异机制 ,致病相关基因对病毒致病力的影响 ,还需要对其他非结构蛋白基因和全长的结构蛋白 E rns、 E1和 E2基因进行研究 。 为了研究猪瘟病毒不同基因对病毒致病力的影响 ,聂玉春等将 C株病毒 E rns、 E1和E2分别替换到石门株全长 cDN A中相应位置 ,经体外转录后转染 PK-15细胞 ,获得的子代病毒滴度 10 6 PFU /m L,带有 C株囊膜蛋白的石门株病毒仍然能够感染 PK-15细胞 ,进一步研究需在动物体内进行。找到病毒的致病相关基因对阐明猪瘟病毒感染和致病机理具有重要意义。

3. 3 临床上猪瘟分离株具有不同致病特征的影响因素 

临床上猪瘟病毒致病性的差异除与病毒毒力有关外 ,病毒与机体之间的相互作用还决定了病毒的感染过程和结果 ,使病毒在传代中逐渐适应于机体 ,最后毒力趋于稳定和相同 ,并完全适应于本动物体内。猪肾细胞 ( PK-15和 SK-6)的细胞膜上存在猪瘟病毒特异受体 ,用猪瘟兔化弱毒株 -C株的囊膜蛋白制备假病毒同样能感染 PK-15细胞 ,表明猪瘟病毒强弱毒株侵染细胞的机制相似;此外 ,临床上由于体内不同抗体水平 (即大面积免疫压力 )对病毒的特异性影响 ,年龄、营养状况、不同的饲养条件、持续感染和免疫耐受等因素对病毒的非特异性干扰 ,导致发病特点表现出轻重缓急 ,初次分离的毒株表现出不同毒力; Vanderhallen等还证实 ,在田间猪瘟的发病可能与病毒种群不均一性有关 ,从而造成病毒在传播过程中形成对种群病毒的优势选择 ,另外 ,环境因素如温度、阳光以及传播途径也对病毒的优势选择具有重要的影响。赵耘等在猪瘟野毒混合毒实验室感染的研究中也得到证实 ,在 3株不同毒力混合感染敏感猪后经序列分析表明其决定作用的是中等毒力毒株。总之 ,猪瘟病毒毒力和致病力关系的研究还需要对其他非结构蛋白基因进行进一步深入研究。

专家介绍
王琴 

作者介绍:我国猪瘟参考实验室核心成员,致力于猪瘟防控技术研究,近年承担近十余项国家科技支撑及农业部有关猪瘟的专项科研项目,获资助约1,000万元。在猪瘟的流行病学、信息系统的建立、诊断系列新技术研发、疫苗效检替代方法、致病机制研究以及猪瘟的防控与净化技术方面取得了突破性进展。

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