登陆 |注册 欢迎登陆畜牧头条网!
鸡蛋中恩诺沙星残留的高效检测方法研究
  

目前,关于抗生素在食品中的检测方法多样且已成熟,但对鲜蛋和蛋制品中恩诺沙星残留的检测方法国内研究较少,且检测成本差异较大。试验拟采用微生物抑制法和高效液相色谱( HPLC) 法对新鲜鸡蛋中恩诺沙星的残留量进行检测,现报道如下。

1、材料与方法

1.1 样品与菌种

鸡蛋,市售。藤黄微球菌、枯草杆菌、大肠杆菌,为黑龙江八一农垦大学食品学院实验室自培菌种。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪[Agilent 1100 ( 附带荧光检测器) ],安捷伦科技有限公司制造; 恒 温 水 浴 锅( HWS24) ,上海一恒科学仪器有限公司生产; 高速离心机( TGL - 16B) ,上海安亭科学仪器厂制造; 电子天平( FA1104N) ,上海民桥精密科学仪器有限公司制造。0.45μm 微孔滤膜、牛津杯,以上仪器设备均由黑龙江八一农垦大学食品学院实验室提供。

1.3 样品处理

微生物抑制法: 称取 10g 均质好的鸡蛋样品于50 mL 离心管中,加磷酸盐 -乙腈混合液 20 mL 充分混合,用涡旋振荡器振荡 5 min,于 70 ~ 75 ℃ 水浴保温 20 min 后 2 000 g 离 心 15 min,取 上 清 液 作 为样液。

PLC 法: 将约 300g 鸡蛋打碎,蛋清和蛋黄搅拌均匀,置于-20 ℃冰箱中保存。准确称取1 g 匀浆后的鸡蛋样品置于50 mL 离心管中,加入10 mL 组织提取液( 0.1 mol /L 磷酸盐缓冲液,pH 值为 7.0 ) ,涡旋振荡混合,于 4 000 r/min 离心 10 min; 取全部上清液转移到另一离心管中,加入 10 mL 水饱和的正己烷,涡旋振荡,4 000 r/min 离心 10 min; 弃去上层,在下层溶液中再加入 10 mL 水饱和的正己烷,同样振荡、离心,用吸管将上层溶液仔细吸净,下层溶液经微孔滤膜过滤,即为上样液。

1.4 色谱条件

色谱柱,Inertsil ODS - 35 μm 250 mm × 4.6 mm( I.D.) ; 流动相,乙腈 0.05 mol /L 磷酸∶三乙胺缓冲液( pH 值为 2. 4) = 19∶81; 检测波长,λex = 280 nm,λem = 450 nm; 流速,1.0 mL /min; 进样量,20 μL。

1.5 标准溶液的制备标准

储备液: 称取一定量的恩诺沙星标准品,用0.1 mol /L NaOH 溶解,再用灭菌去离子水稀释定容至 1 000 μg /mL,置 2 ~ 8 ℃ 冰箱保存,贮存期为 1 个月。标准工作溶液: 吸取一定量的恩诺沙星标准储备液,用 pH 值为 8.0 的磷酸盐缓 冲 液 稀 释 成 0.5,0.25,0.1,0.05,0.025 μg /mL 的标准工作液,当日配制当日使用。液相色谱标准溶液的配制: 准确称取恩诺沙星标准品,用 0.03 mol /L 的 NaOH 溶液溶解并定容,依次用纯化水稀释成恩诺沙星浓度分别为 10,20,50,100,200,500 μg /L 的一系列标准溶液。

1.6 测定

微生物法: 取制备好的检定用平板,在平板底部做好标记,用牛津杯适当间隔置于平板上,每个平板放 2 个,用镊子轻压使其固定,在每个牛津杯上滴加100 μL 测定样品液,同时作阴性、阳性对照,静置10 min,置于37 ℃培养18 h 后观察,用游标卡尺测量抑菌圈直径。每份样品做 2 个平板上的平行试验。HLPC 法: 以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归得定量标准曲线。

2、结果与分析

2.1 微生物法检测结果与分析

用游标卡尺测量测定样品的抑菌圈直径大小,结果见表 1。

微信截图_20171110144509.png

由表 1 可 知,试验菌大肠杆菌抑菌圈直径为15. 20 mm,而藤黄微球菌、枯草杆菌无抑菌圈。由此可见,试验菌大肠杆菌对恩诺沙星呈现强阳性。

在试验过程中发现,测定用平板琼脂的厚度直接影响抑菌圈直径的大小,琼脂厚时抑菌圈小,琼脂薄时抑菌圈大,这与 Mee Wss 和 Milosevic 发现的抑菌圈直径随琼脂的增厚而减小的结论相一致,9 cm的平板加注 8 mL 琼脂较合适 ; 另外,试验平板测定用菌的浓度及加入量直接影响抑菌圈的大小和清晰度,抑菌圈直径大小随着测定菌液浓度的增加而减小,但菌液浓度太稀会导致抑菌圈模糊不清。

2.2 HPLC 检测结果分析

2.2.1 标准曲线 

以标准品浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线,见图 1。所得线性回归方程为 y = 17.989x + 223.53( R2 = 0.990 4) 。恩诺沙星的线性范围为 10 ~ 500 μg /L。100 μg /L 标准品稀释液的色谱图见图 2。

2.2.2 恩诺沙星最低检测限 

将恩诺沙星标准液进行系列稀释,当上样浓度为 5.0 μg /L 时上样 10 μL,信号线与噪音线之比为 2∶1,由此确定最低检测限为0.05 μg。

2.2.3 实际样品中恩诺沙星残留的检测 

随机抽取市售鸡蛋样品各 5 枚用微生物法和 HPLC 法检测。微生物法检测的各 5 枚样品中只有 1 枚能用大肠杆菌检测出恩诺沙星残留,其他样品中未测出恩诺沙星残留。HPLC 法检测到的峰面积代入回归方程测得样品中恩诺沙星含量为 0. 43 ng /mL,被检测出的样品与微生物法检测的恩诺沙星阳性的样品为同一个样品。样品的液相色谱图见图 3。

微信截图_20171110144750.png

由于鸡蛋中含有大量的脂类、蛋白质及氨基酸等干扰组分,样品的提取液呈浑浊状态,若直接上样到固相萃取柱,不但净化效果不理想,而且会造成柱子的堵塞; 因此,在上样前必须对提取液进行预处理,用正己烷萃取 2 次可以基本上去除提取液中的脂类成分,有利于进一步的固相萃取净化。

最佳固相萃取净化条件: 依 次 用 5 mL 乙 腈、5 mL 30% 乙腈 - 0.05 mol /L 磷酸/三乙胺缓冲液和5 mL组织提取液活化柱子; 将鸡蛋提取并经过 2 次正己烷净化后的溶液上样 10 mL; 2 mL 水淋洗,最后用 1 mL 30% 乙腈 - 0.05 mol /L 磷酸/三乙胺缓冲液洗脱。

3、结论与讨论

在试验中,采用微生物抑制法测定的抗生素( 恩诺沙星) 鸡蛋中残留最低检出限为 0.025 mg /kg,符合我国限量要求,是一种高效经济的检出方法; HPLC法微量残留物检测值为0.05 μg,方法快速,简便,灵敏度高,干扰少,适用于大部分食品样品的实验室测定。在测定过程中,HPLC 法将鸡蛋匀浆放进 pH 值为 7.0 的缓冲液中,用正己烷萃取,脱去脂类成分,用液相色谱法分离,有助于减少一些样品中复杂基质的干扰,而且测定最低限量低。

专家介绍
王琴 

作者介绍:我国猪瘟参考实验室核心成员,致力于猪瘟防控技术研究,近年承担近十余项国家科技支撑及农业部有关猪瘟的专项科研项目,获资助约1,000万元。在猪瘟的流行病学、信息系统的建立、诊断系列新技术研发、疫苗效检替代方法、致病机制研究以及猪瘟的防控与净化技术方面取得了突破性进展。

文章 : 5 人气 : 2954

畜牧头条网(xmttw.com)以新锐的视角,专业的态度为中国畜牧人奉献最新、最热、最具价值的行业资讯!关注畜牧头条——今日要闻实时掌握,行业热点任您搜索,专家大咖群英荟萃,行业发展献言献策!畜牧头条——有态度、有深度、有速度的畜牧新媒体!

微信:xmtt2017E

QQ:3261638214

邮箱:xmttw.e@qq.com

地址:北京市顺义区天竺空港经济开发区

版权所有 © 爱牧头条(北京)文化传媒有限公司

以商业目的使用畜牧头条网站内容需获许可。非商业目的使用授权遵循 CC BY-NC 4.0。

All content is made available under the CC BY-NC 4.0 for non-commercial use. Commercial use of this content is prohibited without explicit permission.

Copyright © 2013-2016 畜牧头条 版权所有 备案:鲁ICP备15034375号 站长统计

版权所有 © 爱牧头条(北京)文化传媒有限公司