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鸡传染性支气管炎病毒D41株S1基因部分序列的测定
  

通过反转录及变退火温度PCR 方法扩增出含先导序列的IBV 广东地方分离株  D41 的S1基因cDNA, 长度约1.7 kb.利用双脱氧链终止法对其5′端测序, 准确读到342个碱基, 并确定了翻译起始密码子ATG 的位置。

鸡传染性支气管炎(IB)是严重危害世界养鸡业的一种病毒性疾病, 其病原为鸡传染性支气管炎病毒(IBV).IBV 的基因组核酸在复制过程中易发生突变和高频重组, 从而导致该病毒血清型众多(Cavanagh et al , 1992), 并给IB 的防治工作带来很大麻烦.现已证实, 在IBV 的3 种主要结构蛋白中, 纤突(S)蛋白的S1 糖多肽亚单位与IBV 的免疫原性关系最密切, 血凝抑制抗体和多数病毒中和抗体由S1 诱发, 血清型特异抗体也主要是针对S1 糖多肽的.另外, IBV 基因组中的高变区大多集中在S1 部位(Bernard et al , 1990).所以S1 基因是IBV 的免疫原基因, 研究其序列, 有利于从分子水平上揭示IBV 的变异基础和规律, 并对开发相应的基因工程疫苗有重要意义。

近年来, 我国IB 的流行呈上升趋势, 尤其是肾变病型IB 已蔓延到所有养鸡地区, 造成了严重的经济损失.但目前有关我国IBV 地方分离株的基因序列数据还非常缺乏.本研究的目的就是从IBV 广东地方分离致弱疫苗株D41(陈天杰等, 1987)(简称IBV D41株)入手, 对其S1 基因5′端序列进行测定, 以便确定翻译起始密码子ATG 的位置, 为进一步表达该基因奠定基础。

1 、材料与方法

1 .1 引物的设计与合成

根据血清学实验(陈天杰等, 1987)及RFLP 研究(王林川等, 1997)的结果,D41株很可能属于Mass 血清型, 所以引物设计参照该血清型的标准毒株之一Beaudet te 株的S1 基因两侧序列(Sutou et al , 1988), 并通过PCRDESN 软件辅助分析.上游引物L 5′与王林川等(1997)报道的引物S1 OLIGO5′相同, 位于先导序列5′端, 27 个碱基, 引物5′端加有Hind Ⅲ识别序列.下游引物Lx 按照纤突(S)前体蛋白裂解位点(Sutou et al , 1988)附近的序列设计, 25 个碱基, 其5′端加有Sac Ⅰ 识别序列.两条引物均由上海Sangon 生物工程公司合成, 二者之间包括整个S1 基因片段(含先导序列), 跨幅约1 .7 kb .L 5′和Lx 的序列如下:

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1 .2 病毒的繁殖、纯化及RNA 提取

按陈天杰等(1987)的报道, 用10 日龄SPF 鸡胚(购自山东SPF 鸡场)复壮IBV D41株种毒(广东省农业科学院兽医研究所提供);经蔗糖密度梯度超速离心后, 取适量病毒悬液加入20 mg/L 的SDS 和250 mg/ L 的蛋白酶K , 55 ℃ 45 min ;再用等体积水饱和酚、氯仿/异戊醇(24∶1)反复抽提数次, 经无水乙醇沉淀后, 用DEPC 处理过的灭菌水溶解病毒RNA , 立即进行反转录。

1 .3 IBV D41株S1 基因cDNA第一链的合成及扩增(RT-PCR)

反转录(RT):取病毒核酸溶液(6 .5 μL)与引物Lx(1.5 μL, 45 pmol)于90℃水浴5 min , 再冰浴2min 后加入5 ×RT Buffer(4 .0 μL)、2.5 mmol/L dNTPs(6 .0 μL)、RNasin(Promega 公司, 40 u)及AMV RTase(Promega 公司, 10 u),42 ℃作用1 h .反应产物直接用于PCR 扩增.

变退火温度PCR(简称变温PCR):取10 ×Buf fer 4 .0 μL 、2 .5 mmol/ L dNTPs 4 .0 μL 、引物L 5′1 .0 μL(30 pmol)、RT 产物10 .0 μL 、灭菌水30 .4 μL 混匀, 97 ℃水浴10 min , 冰浴2 min 后加入AmpliTaq DNA 聚合酶(PE 公司, 3 u)及适量灭菌液体石蜡, 于1109 型DNA扩增仪(北京军事医学科学院新技术应用研究所)上执行以下程序:90 ℃ 1 min , 45 ℃ 1 min ,72 ℃ 2 min , 共10 个循环;然后提高退火温度至50 ℃, 其余条件不变, 再经25 个循环后, 72 ℃作用10 min .同时设立无模板阴性对照体系.

1 .4 IBV D41株S1 基因cDNA的克隆

参照BOEHRINGER MANNHEIM 公司的琼脂糖酶使用说明, 纯化上述特异性RT -PCR 产物(约1 .7 kb), 并分别进行Hind Ⅲ和Sac Ⅰ单酶切鉴定.然后, 按常规方法与载体质粒pGEM -7Zf(+)连接、转化.重组质粒采用熊占(1995)报道的方法进行快速筛选, 最终通过质粒PCR 和Hind Ⅲ +Sac Ⅰ及Hind Ⅲ +BamH Ⅰ双酶切鉴定.

1 .5 IBV D41株S1 基因cDNA 5′端序列的测定

用PEG 沉淀法(Sambrook et al , 1989)纯化重组质粒, 然后, 通过Sanger 双脱氧链终止法进行序列测定, 具体操作参照Pharmacia 公司T7SequencingTM Kit 的说明及叶长明(1994)的报道进行.

2、结果

2 .1 引物设计与RT-PCR

PCRDESN 软件分析表明, 上游引物L 5′和下游引物Lx 长度适中, 其内部没有连续4个以上碱基构成反向互补配对序列(即发夹结构), 二者3′端之间无同源性, 不会形成引物二聚体.L5′和Lx 的Tm 值分别为72 和76 .电泳结果显示, 利用这对引物通过RT 及变温PCR 方法成功地扩增出一条长约1 .7 kb 的特异条带(图1), 其大小与预计的完全吻合.阴性对照组无任何产物生成.这说明IBV D41株S1 基因(含先导序列)已被调出并得到扩增.

2 .2 重组质粒鉴定 

IBV D41株S1 基因RT -PCR 产物经Hind Ⅲ和Sac Ⅰ分别酶切, 均未发现模板长度减小, 初步表明该基因内部没有这些内切酶的识别序列存在.将其插入到载体质粒pGEM -7Zf(+)用Hind Ⅲ和Sac Ⅰ 切开的窗口中, 获得重组质粒pGEMIBVS1 -Ⅰ .D41 .该重组质粒经Hind Ⅲ +Sac Ⅰ 双酶切, 产生长约1 .7 kb 和3 .0 kb 的两条带, 它们分别与RT -PCR产物及载体质粒大小一致.而用Hind Ⅲ +BamHⅠ酶切重组质粒, 只得到1 条长约4 .7 kb 的大片段, 说明随着目的基因的正确导入, 原载体上Hind Ⅲ和S ac Ⅰ 之间的BamH Ⅰ 位点消失, 符合预先设计.另外, 用引物L5′和Lx 对重组质粒进行PCR, 得到长约1 .7 kb 的特异性扩增产物.上述结果(图1)表明IBV D41株S1 基因cDNA 已被正确插入载体质粒pGEM -7Zf(+)中.

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2 .3 IBV D41株S1 基因cDNA 5′端序列的测定 

用Sanger 双脱氧链终止法对含先导序列的IBV D41株S1 基因cDNA 5′端人工测序, 其放射自显影结果如图 2和图3 所示。 

3、讨论

3 .1 引物设计

IBV D41株是一个地方分离致弱毒株(陈天杰等, 1987), 要想正确完整地表达其S1 糖蛋白就必须首先确定该基因的翻译起始位点, 这也是本研究的主要目的.现已证明, IBV 基因组的转录遵循特殊的先导—引物转录模式, 其产物是一组长度递减的mRNA , 它们具有共同的5′端先导序列(内含保守性很高的侧翼序列CTG/ TAACAA(Sutou et al , 1988)和3′端序列.所以若上游引物按先导序列中的保守区设计, 则受毒株变异的影响较小, 与模板结合的效率较高.目前, 国内外相关研究中普遍采用这种设计方案, 本文使用的L5′也不例外.另外,L5′的结合部位与翻译起始密码子ATG 之间相隔几十个碱基, 有利于通过测序确定D41 株S1 基因5′端翻译起始密码子A TG 的位置及其附近的序列.

根据前人推测的IBV S 前体蛋白裂解模式, 分析已发表的IBV 不同毒株S 基因序列(Cavanagh et al , 1992 ;Binns et al , 1985 ;Sutou et al , 1988 ;Wang et al , 1993), 发现即使不同血清型的毒株在该部位的氨基酸序列同源性都很高, 而同一血清型的毒株在该部位更有较强的核酸序列保守性.因此, 本人参照与IBV D41株同一血清型的Beaudette 株S1 基因3′端的序列(Binns et al , 1985)设计了与之互补的下游引物Lx , 同时, 在Lx 中加入翻译终止密码子TAG 的互补碱基, 以便限制S2 基因的掺入, 确保下一步获得完整的S1 基因表达产物.实验结果证明, L5′和Lx 的设计是正确合理的.

由于IBV 基因核酸突变率高, 所以引物设计时, 若要人为加入酶切位点, 则需慎重选择并先对PCR 产物做预酶切, 以保证克隆到完整的目的基因.

3 .2 变温PCR 

本研究总结前人经验, 采用变温PCR 扩增RT 产物.其依据是:最初几轮PCR 扩增时,模板与每条引物的实际配对碱基数只有17 ~ 20 个.考虑到引物设计是按标准序列, 而被扩增的模板却来自变异毒株, 因此, 适当调低退火温度, 将有利于引物与模板的稳定结合.经过几轮反应后, 提高退火温度至合适的值, 有助于删减非特异反应背景.实验结果显示, 上述改进的PCR 方法效果良好.

3 .3 测序

本研究报道了IBV D41株S1 基因5′端的部分序列.分析表明, 第一个ATG 附近的序列与IBV Mass 血清型的Beaudet te 株、M41株和H120株S 基因翻译起始密码子附近序列完全一致.若该ATG 是翻译起始密码子, 则随后的17 个氨基酸中大多数是高度疏水性氨基酸, 如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)等, 它们形成了一段较强的疏水区, 并在推导的信号肽切点上游-1 位和-3 位分别是中性的小氨基酸A 和C .这些结构符合信号肽的共同特征(von Heijne , 1984)及Binns 等(1985)和Sutou 等(1988)对S 蛋白信号肽的判断.因

此, 可以认为该ATG 就是IBV D41株S1 基因翻译起始密码, 它与随后的17 个氨基酸一起编码S 蛋白的信号肽.这一发现为进一步完整表达该基因创造了有利条件.

专家介绍
廖明 

作者介绍:廖明,1968年生,中共党员,博士,华南农业大学副校长、教授,博士生导师,广东省“珠江学者”特聘教授,华南农业大学“预防兽医学”国家重点学科和“兽医学”广东省重点学科带头人。2013年6月,获“全国师德楷模”荣誉称号。 2017年05月,获得全国创新争先奖。

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