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我国集约化猪场新发猪丁型冠状病毒病的诊断
  

猪丁型冠状病毒(PDCoV)是一种国外新发现的猪腹泻病原,我国广泛存在猪流行性腹泻,但至今未见猪丁型冠状病毒感染的正式报道。2015 年 7 月,在存栏 2 000 头基础母猪的华南某集约化猪场 5 至 15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻,发病率90%、死淘率90%以上。经实验室PCR诊断为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和轮状病毒(RV)检测均为阴性。用特异性的 PDCoV N 基因引物经 RT-PCR 扩增显示为强阳性。在此基础上,对扩增产物进行了基因测序和遗传变异分析,显示该毒株在 PDCoV 新的遗传分支上,与其他 PDCoV 有显著区别。本研究首次报道我国出现了猪丁型冠状病毒病的新病例,毒株命名为PDCoV Ch-A。

猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),是一种新发现的冠状病毒,它主要感染整段小肠,尤其是空肠和回肠,引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐。2009—2010 年 PDCoV 在中国香港首次报道该病毒。2014 年初,在美国首次报道猪群该病的流行,此后至少有 19 个州有该新型冠状病毒的报道。在美国,猪丁型冠状病毒感染与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)的临床发病情况比较相似,但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病可引起乳猪腹泻和呕吐,发病率和死亡率高达 50% ~ 100%,生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。

1、 材料与方法

1.1  病料

来自华南某集约化猪场(2 000 头基础母猪)3 ~ 7 日龄的乳猪 5 头,全场乳猪发生严重腹泻,传播迅速,发病率90%、死淘率 90% 以上。采集发病猪的小肠,按 1 ∶ 5 研磨制备成病料,-80 ℃冻存待检。

1.2  主要试剂

RNA 抽提试剂盒购于上海百赛生物科技有限公司,反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP、18T 载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5α 感受态细胞等购自 TAKARA 公司。

1.3  引物设计与合成

本实验室根据 GenBank 所发布的序列号,选择 N 基因,运用 Primer Premier5.0 分别针对 PDCoV、PEDV、TGEV、和 RTV(猪轮状病毒)设计 4 对引物,由睿博兴科生物技术有限公司合成,预计扩增的特异性基因片段大小为 482 bp、450 bp、810 bp 和 620 bp。

1.4  总 RNA 的提取

病料经离心取上清液,按照 ANYGEN 核酸提取试剂盒说明书提取病毒总 RNA,然后用物 RNA 酶的水溶解,放在 -80℃保存。

1.5  RT-PCR 的检测

反转录体系 :ddH 2 O 4 μL,下游引物 R 1μL,RNA1μL,70 ℃水浴 10 min 冰浴 2 min ;5×MLV buffer 2μL,ddH 2 O 1μL,dNTPs 0.5μL,RNA 酶 抑 制 剂 0.25μL,MLV 反转录酶 0.25μL,42 ℃水浴 1 h,72 ℃水浴 15 min冰浴至冷却。

PCR 体 系 :ddH 2 O 32.5μL,10×MLV buffer 5μL,dNTPs 4μL,F 2μL,R2μL, cDNA 4μL,rTaq 0.5μL。反应条件为 94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃30 s,30Cycles ,72 ℃ 7 min,PCR 反应产物于 1.0% 琼脂糖凝胶电泳。

1.6  克隆

将阳性 PCR 产物经纯化回收后与 PMD-18T 载体连接,转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中,培养后挑单个菌落进行 PCR 鉴定,鉴定成功的重组质粒送往睿博兴科生物技术有限公司进行测序。

1.7  序列分析

将 RT-PCR 扩增 获 得 的 N 基 因 进行克隆、测序,利用MEGA6 软件处理,与GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的 N 基因序列(表 1)进行同源性比对分析,并绘制系统进化树。

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2、结果与分析

2.1  病猪症状和病变该 集 约 化 猪 场 

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5至 15 日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻,迅脱水死亡,死淘率高达90%以上。症状见剖检病变见图1和图2。主要在小肠,肠管明显扩张 , 内充满黄色液体 , 肠壁变薄、松弛、小肠黏膜充血 , 肠系膜呈索状充血。

2.2  4 种病毒 N 基因扩增

应用 RT-PCR 方法对样品进行了 PEDV/TGEV/RV/PDCoV 检测,结果显示 PEDV/TGEV/RTV 未能扩增出目的条带,而 PDCoV 扩增出与预期大小一致片段,约 482 bp,电泳图见图 3。检测结果显示该病料 PEDV/TGEV/RTV 为阴性,PDCoV为强阳性,说明该猪场可能存在PDCoV的感染。

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2.3  PDCoV N 基因序列分析

由测序结果可知,Ch-A测序的 N 基因中间存在一个核苷酸的缺失、几个突变。运 用 DNAstard 软 件 将 测 序正 确 PDCoV N 基 因 序 列 与GenBank 上已发表的国内外毒株 N 基因参考序列进行同源性比对分析,结果显示获得 PDCoV 毒株 N 基因之间的核苷酸序列同源性为 98.3% 到 100%,氨基酸序列同源性为95.0% 到 100% ;其中 TX 与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为 98.3% 到 99.0%,氨基酸同源性为 95.0% 到 96.9%,显示与中国香港毒株 HKU15-155 同源性最低 ;与韩国和美国毒株相比核苷酸同源性为 98.8% ~ 99.0%,氨基酸同源性为96.2% 到 96.9%(结果见图 4、图 5)。

2.4  PDCoV N 基因遗传进化分析

运用 MEGA 6.06 软件绘制 N 基因系统进化树,结果表明我国新出现的猪丁型冠状病毒(Ch-A)与国内外报道的猪丁型冠状病毒亲缘关系较远,它单独在一个新的分支上。说明这是在我国新发现的一个新毒株(结果见图 6)。

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3、讨论

自 2013 年至今,新出现的 PEDV 和 PDCoV 已遍布美国,造成大量猪死亡。目前国际上正在形成该病毒相关研究热点,也发表了少量的报告。但国内至今未见该病毒为主因在猪场暴发和流行的报道。

我们首次报道了国内集约化猪场暴发猪丁型冠状病毒病。通过设计 4 对冠状病毒引物,在检测 PEDV、TGEV 和 RTV为阴性后,进一步设计引物扩增 PDCoV,显示为强阳性。对PDCoV HN 株的 N 基因进行测序,并与国内外已公布的序列进行系统进化树分析,结果显示:该 PDCoV 毒株(Ch-A)与 GenBank 上公布的美国株及中国株不在一个分支上,是新发现的一株新型冠状病毒病。该分支的毒株是否与本次发病的高致病力有关值得深入研究。仍然未知该病毒是怎么传入我国及其在我国各地的感染情况。

老病未消除、新病涌现,需高度重视和立即加强研究对猪丁型冠状病毒的监测和系统性研究,降低给养猪业带来的损失和威胁。

专家介绍
贺东生 

作者介绍:贺东生博士、华南农大教授、博士生导师。现任国家农业部兽药疫苗评审委员会委员、广东省生猪产业体系猪病岗位科学家。美国康州大学访问教授、弗吉尼亚大学博士后、华南动物疫病检测中心主任,动物防疫学会和养猪协会专家委员。中国著名猪病实战专家、疫苗研发和猪病防控科学家,专长猪病综合诊断、生产防控、疫苗研发和应用。历任多家著名疫苗厂、集团猪场顾问,成功防控疫病数千例。有7 项疫苗产品成功出让给江苏四川和广东的著名疫苗企业。

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