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油菜花粉超微粉有效成分山奈酚在家兔的药代动力学研究
  

目的  研究超微粉碎技术对油菜花粉有效成分山奈酚的药代动力学影响。 方法  油菜花粉分别制成超微粉和细粉,灌服家兔,用 HPLC 法测定家兔体内山奈酚的血药浓度,血药浓度-时间数据经药代动力学分析(pharmaceutical kinetics software, PKS)软件处理,比较油菜花粉超微粉和细粉中的山奈酚在家兔体内的药代动力学参数。 结果  油菜花粉超微粉和细粉中山奈酚的药代动力学最佳模型均为一级吸收二室模型。其主要药代动力学参数分别是:吸收相半衰期(t1/2   ka)为 1.72 和 1.57h,消除相半衰期(t1/2  β)为 2.97 和 1.99h,达峰时间(Tpeak )为 3.64 和 3.71 h,达峰浓度(Cmax )为 0.2808 和 0.2455 g/ml,药时曲线下面积(AUC0→t )为 1.8897 和 1.4599 (g/ml)h。与细粉比较,油菜花粉超微粉达峰时间缩短;达峰浓度提高;药时曲线下面积增加。 结论 油菜花粉经超微粉碎后,可显著提高其有效成分山奈酚的生物利用度。 [营养学报,2012,34(2):150-153]

油菜花粉即是一种新型植物食品资源,又可作为药物用于临床治疗。油菜花粉中黄酮类化合物含量丰富,有抗氧化、抗炎、抗辐射、抗癌和预防心血管疾病等药理活性。

家兔灌服油菜花粉细粉和体外溶出度试验表明超微粉碎可提高油菜花粉山奈酚的溶出量,该技术显出特有优势。目前对经超微粉碎后有效成分山奈酚在体内的药代动力学研究未见有报道。本研究采用高效液相色谱法测定家兔体内山奈酚的血药浓度,比较油菜花粉超微粉、细粉中山奈酚在家兔体内的药代动力学参数,以期揭示油菜花粉经超微粉碎后主要成分在体内的变化规律及其生物利用度,为油菜花粉的临床合理用药、提高疗效提供了实验数据。

1、材 料 与 方 法

1.1 材料

油菜花粉(福建农林大学蜂学学院)。植物试样粉碎机粉碎,过 65 目筛经超微粉碎机粉碎,过 300 目筛。试验前 40℃干燥至质量恒定,给药前用蒸馏水配成悬浮液。

1.2 试剂与仪器

山奈酚(中国药品生物制品检定所); β -葡萄糖醛酸酶(IX-A 型,从大肠杆菌中提取,活力为 1 660 000U/G)、硫酸酯酶(H-1 型,从蜗牛肠液中提取,活力为 14 000 U/G)和抗坏血酸,购自 Sigma 公司;肝素钠,上海惠兴生化试剂公司;甲醇(色谱纯);其余试剂均为分析纯。SQW26BL 三清植物超微粉碎机(山东三清不锈钢设备公司);XSB270B 型Ф200 标准筛振筛机(柳州探矿机械厂);高效液相色谱仪(Agilent1100),配置四元泵(带真空脱气机)、PAD 检测器、化学工作站;手动进样器;固相萃取仪 BF-S2500型(北京八方世纪科技公司);200 mg/3ml 固相萃取小柱 Agilent ODS(C18);氮气吹干仪 HSC-24A型(北京八方世纪科技公司)。

1.3 动物

健康家兔 14 只,体质量 210~215 kg,雌雄兼用,由福建医科大学实验动物中心提供。

1.4 色谱条件

色 谱 柱 : Agilent ZorbaxSB-C18(250mm ×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.4%磷酸(二者体积 比 55:45) ; 检 测 波 长 λ =360nm ; 流 速1.0 ml/min;柱温 25℃;进样量 50μl。

1.5 血样采集与处理

健康家兔 14 只随机分成 2 组,每组 7 只,试验前禁食(不禁水)12 h 以上。按 15 g/kg 剂量一次性灌服油菜花粉超微粉和细粉,分别于给药后 5、10、30、50、80、100 min、2、2.5、3、4、5、8、9、10、12、16、24h 由颈静脉采血 2~3ml,收集于肝素化的离心管内,离心(10 min,4000 r/min),分离出血浆,于-20℃冻存待测。在固相萃取仪上对 C18 萃取小柱进行活化。先以甲醇(3 ml)润湿活化,然后分别以水(1 ml)和 0.1%磷酸(1 ml)冲洗平衡小柱。精密量取血浆样品 800 μl,加 8O μl 0.1 mol/L 抗坏血酸,再加 8O μl 0.58 mol/L 醋酸,旋涡混匀使之酸化,加入β-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶各 4O μl(终浓度分别为 4OO U/ml 和 20U/ml),混匀,37℃水浴振荡孵育 2h,取出,置冰浴中 8 min,离心(10 min,15 000 r/min)。上清液加已活化的固相萃取柱,以 1 ml 甲醇-0.1%磷酸水溶液(二者体积比 1:9)淋洗,最后用 2 ml 甲醇洗脱,收集洗脱液,37℃水浴下氮气流挥干。以 0.2 ml 流动相充分溶解,漩涡 1 min,超声 10 min,离心(10 min,4000 r/min)。吸取 50 μl 上清液进行 HPLC 分析。

1.6 数据处理

数据以药代动力学软件 PKS 处理,进行优度选择和房室模型拟合,计算药代动力学参数。

2、结 果

2.1 色谱分析

(图 1-4)图 1、2 为家兔空白血浆色谱图和空白血浆加标准品的色谱图;家兔灌服油菜花粉超微粉和细粉后血浆中山奈酚色谱图见图 3、4。

2.2 线性范围

精密称取经五氧化二磷干燥过夜的山奈酚对照品 6.50 mg,置 25 ml 棕色容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配成山奈酚质量浓度为 260 μg/ml 的对照品溶液,于冰箱中-4℃保存备用。取一定量空白血浆,加山奈酚对照品溶液,依次配制成质量浓度为 0.019、0.038、0.076、0.152、0.304、0.456、0.608μg/ml 的系列对照血浆样品。进行 HPLC 分析。得山奈酚回归方程:A=997.57C-0.3559,r2 =0.9936 ( n =7)。山奈酚血浆浓度测定法线性范围是 0.019~0.608μg/ml。以信噪比 S/N>3 计,最低检测限为 3 ng/ml。根据标准曲线,山奈酚定量下限为 0.019 μg/ml。

2.3 回收率测定

分别取空白血浆加山奈酚标准液,配制成含山奈酚 0.019、0.152、0.608μg/ml 的溶液,每种浓度设 3 个平行( n =3),测定相应峰面积,计算回收率。低、中、高 3 个浓度的平均回收率分别为 80.23%、84.27%、83.42%,RSD 分别为 4.83%、3.87%、2.96%。结果表明本方法重现性良好。

2.4 精密度测定

分别取空白血浆加山奈酚标准液,配制成含山奈酚 0.019、0.152、0.608μg/ml 的溶液,每种浓度设 5 个平行( n =5),测定其相应的峰面积。日内精密度(每间隔 1 h 测定 1 次)共测 5 次。日间精密度(每日测定 1 次)连续测定 5 d。含山奈酚 0.019、0.152、0.608μg/ml 的家兔血浆中,山奈酚的日内精密度与日间精密度结果见表 1。

微信截图_20171124093610.png

2.5 家兔山奈酚的 C-T 曲线(图 5)

家兔灌服油菜花粉 (15g/kg) 超微粉和细粉后,血浆中山奈酚的浓度分别在给药后 2.5~3 h和 3~5 h 达到高峰浓度-时间(C-T)曲线。

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2.6 药代动力学参数

两组家兔测得血药 C-T 数据,用药代动力学软件 PKS 进行处理,计算得出主要药代动力学参数见表 2。油菜花粉超微粉山奈酚的吸收相半衰期t1/2 ka 延长,分布相半衰期 t1/2α 延长,消除相半衰期 t1/2β 延长,达峰时间 Tpeak 提前,达峰浓度 Cmax 增加,药时曲线下面积 AUC 增加1Tpeak、Cmax、AUC 均为计算值,其中 AUC 计算方式为梯形法。说明超微粉在家兔体内吸收快。

微信截图_20171124094135.png

3、讨 论

本试验中所得的血药 C-T 数据经 PKS 软件处理,按一室、二室模型进行模拟,根据 F 检验和AIC 值选择房室数,确定家兔灌服油菜花粉超微粉和细粉后,其有效成分山奈酚在体内的代谢过程符合一级吸收二室模型。说明超微粉和细粉中山奈酚在家兔体内的代谢方式基本相似,都为一级吸收二室开放模型。上述结果表明,油菜花粉超微粉碎后基本的药物成分的功效没有改变。

家兔灌胃油菜花粉后,从胃肠道 5min 即可测到。达峰时间较长(T peak >3 h),说明山奈酚在体内的吸收较缓慢。这是由于固体剂型药物的吸收主要包括药物释放和溶解两个步骤,即油菜花粉在水溶液中先崩解成颗粒的粗分散体,进而释放药物,药物只有溶解于体液后才能被吸收。达峰浓度都较低,可能是口服给药受到胃肠道内的代谢和分解以及肝脏首过效应的影响,导致进入体内血液循环的药量较低。山奈酚吸收进入体内后,在肝脏进行二相代谢。山奈酚的消除相半衰期较槲皮素的小,说明其比槲皮素在家兔体内的消除较迅速。山奈酚在兔体内有较大表观分布容积(V d ),说明可能在组织体内分布广泛,也有可能在某一深部组织大量储存。

达峰时间(T    peak )、达峰浓度(C    max )、药时曲线下面积(AUC)是衡量药物吸收速度与程度的重要参数,这些药代动力学参数不仅反映药物的吸收特征,也是药物在体内吸收、分布、代谢、排泄(ADME)过程的综合反映。与细粉组比较,油菜花粉超微粉中山奈酚的达峰时间T peak  缩短了0.07h,说明超微粉吸收较快;C     max 提高了14.36%,说明超微粉比细粉吸收的更多、更完全;两者的AUC    0→t 分别是1.8897 和1.4599(?g/ml) ? h,超微粉中山奈酚的相对生物利用度提高了29.44%,表明超微粉比细粉生物利用度大。并且与细粉组比较,超微粉组的T   peak 、C   max 、AUC均有显著性差异( P <0.05)。对固体药物来说,溶出是吸收的前提,药物粉体粒径越小,比表面积越大,溶出越快,吸收越好。超微粉颗粒小,有效成分充分暴露,可溶性成分迅速溶解,又超微颗粒具有表面效应、体积效应、量子效应和宏观隧道效应,对物质吸附性较大,因而细胞级微粉油菜花粉对肠壁的黏附作用增强,使颗粒紧紧粘附于胃肠道黏膜上,增加在肠内停留时间,有利于有效成分吸收。

专家介绍
俞道进 

作者介绍:俞道进博士,现任福建农林大学动物科学学院教授、硕士生导师、系主任。中国畜牧兽医学会药理与毒理学分会常务理事。2003年华南农业大学基础兽医学专业研究生毕业,获博士学位。

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